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浅谈蛋白纯化过程中缓冲液的选择

来源:admin  浏览量:  发布时间:2017-08-04 15:09:53

蛋白制备及纯化过程中缓冲液的选择?#27973;?#37325;要,合适缓冲液才能保证蛋白的活性和结构稳定。


概述


当我们纯化蛋白时,最重要的就是要保持蛋白在纯化过程中不能失活,或者是尽量降低纯化过程对蛋白活?#28304;?#26469;的损失。这就意味着蛋白在整个纯化过程中要始终保持可溶性和活性。


因此设计一个防止蛋白降解和聚合的蛋白纯化缓冲体系就?#27973;?#37325;要了,尤其会凸显在实验结果上。在设计缓冲buffer时应考虑以下几个因素:pH值、缓冲体系、盐离子、还原剂和稳定剂。其中每一个因素?#23478;?#26681;据你的目的蛋白进行优化,并以目的蛋白的活性作为优化的评估标准。


1.pH


很多实验的pH值设定在 7.4以模仿生物条件。假如你的蛋白在这个pH值下是稳定的,那就?#27973;?#26834;了!如果不是,?#25176;?#35201;改变pH值?#19994;?#30446;的蛋白在溶液中处于可溶性且?#25442;?#38477;解的状态。


一个经验法则是:蛋白在它等电点pI附近的pH?#31561;?#28082;中会表?#20540;?#19981;易溶解,因为蛋白在其等电点的pH?#31561;?#28082;中表面没有净电荷,从而容易聚集。这里推荐用Expasy的ProtParam工具快速简便地计算蛋白等电点pI值,只要提交蛋白序列?#32431;傘?/span>


2.缓冲体系


一旦确定了缓冲液的pH值,?#25176;?#35201;选择使用什么样的缓冲体系。首先是在选择缓冲体系时要确保选择的缓冲体系在你设定的pH值上确实具有缓冲能力。选择的缓冲体系,其解离常数pKa值应该在设定的pH上下一个pH值单位内。


再者是确保你使用的缓冲液浓度足够高?#28304;?#21040;实际缓冲溶液的作用,正常一般选择的浓度是20~100mM。需要?#20146;?#30340;是你所使用的缓冲体系不应该影响蛋白活性!例如,磷酸盐会抑制激酶的活性,所以反应前应彻底地透析掉。


此外,一些缓冲体系对温?#30830;浅?#25935;感,例如Tris-HCl缓冲液,如果你在25℃时将缓冲体系调至pH值8,pH值将在5℃时增加到8.58而在37℃时降到7.71。所以,如果打算在4℃条件下保存蛋白或在37℃进行实验,就应该考虑到室温下调的pH值可能在实验条件中就不适用了。


3.盐离子


许多缓冲液中含有NaCl,以帮助保持蛋白的可溶性和模拟生理条件。一般常用150 mM的NaCl。


在不同的蛋白纯化步骤中,可能需要改变盐离子的浓度。例如,如果是通过离子交换层析进行蛋白纯化,一开始需要降低盐离子的浓度(5~25mM)避免高离子强度和蛋白竞争和填料结合,这样可防止蛋白从离子交换柱中流穿,从而使柱子能够结合目的蛋白,洗脱除去杂蛋白。


其他类型的色谱分离柱,如凝胶过滤柱和Ni2+ 亲和层析柱,可能需要更高的?#38395;?#24230;。我一般用高达500 mM NaCl进行高盐淋洗,以防止蛋白和柱之间的非特异性结合。最后通过汇琼凝G25凝胶柱将目的蛋白置换到一个新缓冲?#38395;?#24230;的体系中。


4.还原剂


如果你的蛋白质含有半?#35013;?#37240;残基,半?#35013;?#37240;残基间的氧化可能会成为一个trouble,并可能导致蛋白聚集。为了防止这一点,往往会在缓冲液中添加一些还原剂,如DTT,TCEP或者巯基乙醇。


总的来说,TCEP是这三个还原剂中最稳定的,但它也是最昂贵的。我通常在纯化过程的缓冲液中添加DTT,在最后保存酶液的缓冲液中添加TCEP。一般比较合理的还原剂浓度是5~10mM。基本上你要确保还原剂浓度要?#23545;?#39640;于你的蛋白浓度。因为DTT和巯基乙醇在室温下就会降解,所以需要将添加了还原剂的缓冲液处于低温保藏,或者在使用时再添加还原剂。


使用时确保柱材料能够与这些还原剂相容。例如,浓度的还原剂会脱掉镍柱中的镍,并使柱子颜色变深?#39318;?#33394;(这个时候就可以考虑武汉汇研生物科技股份有限公司(www.kw830.com)的高耐受镍柱 汇琼亲 Ni-6FF(TED),汇研TED镍柱可以耐受10mM的还原剂和100mM的EDTA,虽然柱子很容易进?#24615;?#29983;,但你的蛋白挂载量将会受?#33014;?#22823;影响。许多柱材料都会列出其所能够承受还原剂的最大浓度,但是我觉得或多或少都会产生影响,并不在于是否达到最大浓度值。

5.稳定剂


最后,可以通过添加一些稳定剂到蛋白纯化缓冲液中,以帮助提高蛋白纯化时的溶解度和稳定性。在缓冲液中添加惰性蛋白BSA?#25345;?#31243;度可以稳定蛋白,但必须确保这些?#23588;?#30340;稳定蛋白不干扰实验。有时添加甘油、聚乙二醇等添加?#37327;?#20197;增加缓冲液粘度,有助于防止蛋白聚集。另外,使用少量的表面活性剂和一些离子化合物如硫酸盐、氨基酸、柠檬酸等可以屏蔽蛋白间的离子相互作用,帮助蛋白溶解。

通过调整蛋白纯化缓冲液的pH、缓冲体系、盐离子、还原剂和稳定剂,可以建立一个完善的蛋白纯化缓冲体系,可以保持蛋白在纯化过程中的活性和稳定性!这一生产调整?#27973;?#26377;利于蛋白产品、酶制剂产品以及抗体药物产品分离纯化后处理的生产工艺开发!





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