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原创|猪圆环疫苗纯化工艺的初探

来源:admin  浏览量:  发布时间:2017-06-14 09:10:26

摘要:

   


国内绝大部分动物疫苗都是灭活、减毒或无毒的病原体疫苗(第一代动物疫苗),灭活、减毒或无毒的病原体疫苗因为残留大量的病原体及其碎片、HCP、DNA片段而导致免疫后动物出现不同程度的不良反应,而且疫苗免疫原性和反应原性?#31995;汀?#38754;对上述动物免疫后出现的不良反应,均采用基因改造、更换表达系统、添加蛋白标签来提高产量、纯度,从侧面降低副反应。而这些方式所达到的效果均不显著,而?#33402;?#19977;种方法会涉及到生产工艺的变更和疫苗免疫原性和反应原?#22278;?#21516;程度的降低。

猪圆环疫苗现状

     猪圆环病毒疫苗(porcine circovirus,PCV)有两个血清型PCV-1和PCV-2,其中PCV-1为非致病性的病毒,PCV-2为致病性的病毒,是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原。

近年来,随着动物疫苗在疾病预防中的地位日益重要,很多企?#34507;?#30740;究力量?#24230;?#21040;新的疫苗生产工艺上,对疫苗质量要求也日益提高。猪圆环疫苗评价指标中,除抗原含量外,应激反应是另一重要指标。猪圆环疫苗之所?#28304;?#22312;应激反应,是因为现有生产工艺在获得PCV2抗原的同时,不可避免地伴生了大量异源的与猪圆环病毒免疫无关物质(占比99%以上)。通过分离纯化的猪圆环病毒疫苗,不仅可以浓缩提高抗原含量,使抗体效价显著提升,抗体高峰期提前,还能大幅去除非抗原蛋白,降低应激反应。

猪圆环疫苗的生产方式主要为灭活疫苗和基因工程苗。不同生产方式的疫苗,所需纯化的工艺也不同。国内猪圆环疫苗种类、毒株、生产企业名录详见表1。

 

              表1:国内猪圆环疫苗种类、毒株、生产企业名录

疫苗种类

毒株

生产企业

 

猪圆环病毒2型

基因工程苗

CP08

武汉中博、金宇生物

 

 

猪圆环病毒2型

灭活疫苗

SH

江苏南农高科、普莱柯、吉林正业

LG

哈尔滨维科生物、海利生物

WH

广东永顺、武汉中博、武汉科前、中牧股份、南京天邦

ZJ/C

齐鲁动保、浙江诺倍威、瑞普生物、四川华派、浙江荐量

DBN-SX07

大北农、成都天邦、山东华宏

YZ

金宇生物

            资料来源:长江证券研究所研究报告

灭活疫苗的纯化工艺

    灭活疫苗多采用微载体悬浮培养的方式来获得高滴度病毒,灭活疫苗的生产方?#38477;?#21040;全病毒颗粒,根据病毒颗粒与杂质分子量的差异,采用4FF或6FF等凝胶过滤介质进行组分分离,病毒颗粒经过层析柱外水体积(层析填料微球之间的孔隙,路径短)先流出,而蛋白质和核酸经过层析柱内水体积(层析填料微球内部的孔径,路径长)后流出,从而达到分离目的。该纯化工艺的回收率超过70%,缺点是层析填料用量大,上样量不能超过层析填料体积的30%,纯化效?#24335;系汀?#20135;品参数详见表2。


表2:4FF、6FF产品相关参数(凝胶过滤系列)

产品名称

粒径(um)

排阻限(球蛋白)

线性流速(cm/h)

操作耐压(MPa)

高温高压(水中)

汇琼凝4FF

45-165

3×107

300-600

0.3

121℃,20min

汇琼凝6FF

45-165

4×106

250-600

0.3

121℃,20min 

基因工程苗的纯化工艺

PCV-2含有两个功能性的开放阅?#37327;潁∣RF),其中ORF2编码Cap蛋白是猪圆环病毒的主要结构蛋白,可自我装配成病毒性粒子,并含有可中和病毒的抗原表位,可诱导机体产生较强的抗体反应并获得免疫保护,是设计猪圆环疫苗的首选目标基因。

1、原核表达的纯化工艺

在原核表达中,应用较广的是通过将PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入大肠?#21496;?#21407;核载体中,利用大肠?#21496;?#36827;行PCV-2的Cap蛋白与组氨酸(His标签)融合表达,获得含His标签的Cap蛋白,制备亚单位疫苗。

原核表达生产方?#38477;玫胶?#26377;组氨酸(His标签)的蛋白,根据蛋白质侧链上的组氨酸(His标签)对Ni2+等金属离子有高选择的特异性,采用Ni-6FF的亲和层析介质进行分离纯化,由于不同的螯合配基与Ni上的6个原子键结合数量不一样,故Ni-6FF分为3种类型:IDA为3个原子键结合配基,3个原子键结合蛋白;IMAC为4个原子键结合配基,2个原子键结合蛋白;TED为5个原子键结合配基,1个原子键结合蛋白。该纯化工艺的回收率和纯度?#20146;?#39640;的,缺点是原核表达容易出现包涵体,需要加入尿素或盐酸?#21307;?#21253;涵体进行溶解后纯化,然后将纯化得到的蛋白进行复性来提高疫苗效果,蛋白复性的难度较大,操作也较为繁琐。产品参数详见表3。

 

表3:Ni-6FF产品相关参数(亲和层析系列)

产品名称

结合

能力

粒径  (um)

蛋白载量

(mg/ml)

线性流速

(cm/h)

特点

汇琼亲Ni-6FF(IDA)

45-165

40-50

300-600

不耐受还原剂及螯合剂

汇琼亲Ni-6FF(IMAC)

45-165

45

300-600

耐受低浓度还原剂和螯合剂

汇琼亲Ni-6FF(TED)

45-165

20-30

150-600

耐受高浓度还原剂、螯合剂及强碱

 

2、真核表达的纯化工艺

在真核表达中,应用较广的是通过将PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入到昆虫杆状病毒,用昆虫细胞培养,获得重组的PCV-2的Cap蛋白,制备亚单位疫苗,目前昆虫杆状病毒表达Cap蛋白制备的基因工程亚单位疫苗已实现商业化应用,故详述该纯化工艺的商业化应用。

真核表达生产方?#38477;?#21040;不含标签的蛋白,根据蛋白的等电点(pI)在不同pH条件?#28388;?#24102;电荷种类不同,采用Q-HPR或SP-HPR通过配基所带相反电?#23665;?#34892;异性电?#19978;?#21560;。蛋白缓冲液中pH>pI,蛋白带负电荷,选用Q-HPR强阴离子交换介质;蛋白缓冲液中pH<pI,蛋白带正电荷,选用SP-HPR强阳离子交换介质。昆虫杆状病毒表达系统使用的培养基等原材料成本?#27973;?#26114;贵,为降低纯化工艺中的损失,回收率成为纯化工艺要求最主要的指标。产品参数详见表4。

 

表4:Q-HPR、SP-HPR产品相关参数(离子交换系列)

产品名称

粒径

(um)

离子载量(umol/ml)

功能载量

(mg/ml)

线性流速

(cm/h)

操作耐压

(MPa)

汇琼离Q-HPR

25-45

180-250(Cl-

120(HSA)

300-400

0.5

汇琼离SP-HPR

25-45

180-280(H+

100(Lysozyme)

300-400

0.5

应用数据
1、纯化?#35745;?/section>




2、纯度检测


表5:纯化前后样品信息

          检测指标

纯化前后

纯度(%)

抗原含量(μg/ml)

外观

应激反应

颜色

可见杂质

纯化前

≤40%

90-100

黄色浑浊

细胞碎片可见

反应剧烈

纯化后

≥85%

≥500

?#35813;?/span>

?#31995;?/span>

纯化后回收率:75-85%

发展?#36739;?/section>

传统疫苗的生产工艺中,仅通过离心、过滤和沉淀技术等手段进行简易的分离,现将离心、过滤、层析等方法的有力结合,逐渐成为动物疫苗分离纯化的主流,应用先进的浓缩和分离纯化技术是提高疫苗效价、降低应激反应的有效手段,精制疫苗将成为今后发展的必然趋势。由于本人仅专注于纯化工艺的开发,文中错误还望各位读者批评指正,互相学习,共同进步!



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