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Ni Focurose 6FF (TED) 哺乳动物细胞表达HIS蛋白优选

价 格:询价

规 格:25ml

产 地:中国

货 号:HZ1003-8

品 牌:汇研生物

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产品介绍

Ni Focurose 6FF (TED

为确保产品的性能和无忧的操作,使?#20204;?#35831;仔细阅读本手册,有任?#25105;晌是?#21672;询本公司售后技术支持或当地的销售人?#20445;?#32852;系方式见附录)。

1.产品介绍

Ni Focurose 6FF (TED是利用Ni2+与蛋白质侧链上的某些氨基酸(主要为组氨酸、半?#35013;?#37240;、色氨酸)相互作用而进行分离纯化,适用于His标签蛋白及与Ni2+具有相互作用的生物分子的分离纯化。强结合的Ni2+可以直接用于真核表达系统分泌表达的His标签蛋白且耐受更高的还原剂、螯合剂,无需进行样品前处理;介质的清洗再生工作简单,无需脱镍直接进行NaOH清洗。

特点如下:

a.快速、简单(一步纯化)。

b.耐受更高的还原剂、螯合剂,真核分泌表达的His标签蛋白无需前处理?#32431;?#19978;样,最大限度的保护蛋白活性。

c.无需脱镍直接进行NaOH清洗,大大缩短了清洗周期。

d.镍脱落比传统Ni Focurose 6FF (IDANi Focurose 6FF(IMAC更低,无需反复再生。

表1:介质性能?#38382;?/span>

基质

高度交联6%的琼脂糖

粒径范围

45-165μm

平均粒径

90μm

结合载量

20mg(His标签蛋白)/ml(介质)

pH稳定性

3-12(工作)2-14(清洗)

化学稳定性

0.01M盐酸、0.01M氢氧化钠(一周)

20mM EDTA10mM DTT1M氢氧化钠、8M尿素、6M盐酸胍(24小时)

100mM EDTA、0.5M 咪唑(2小?#20445;?/span>

30% 异丙醇(20分钟)

兼容性

所有在Ni-6FF(IMAC)中正常使用的溶液

流速

600cm/h

操作压力

0.3MPa

贮存溶液

20%乙醇

贮存温度

4-30

2.使用(以HT 1ml和HT 5ml为例)
a.
水洗

用5-10CV纯化水0.5ml/min(HT1ml)或2.0ml/min(HT 5ml)清洗介质

备注:此步骤用于去除介质中20%乙醇。

b.?#33014;?/span>

用5-10CV?#33014;?#28082;以0.5ml/min(HT1ml)或2.0ml/min(HT5ml)?#33014;?#20171;质,直至基线平稳后调零

备注:此步骤用于?#33014;?#20171;质,保证介质中的溶液的组分和pH与样本一致

c.上样

样品经过离心、过滤(0.45um)后以0.2ml/min(1ml)或1.0ml/min(5ml)进行上样,上样完成后用?#33014;?#28082;清洗直至基线为零。

备注:蛋白的结合能力随着裂解物类型、目标蛋白性质、流速、pH变化而变化,低流速常常能增加样本的结合效率

d.洗杂

用5-10CV洗杂液以0.5ml/min(HT1ml)或2.0ml/min(HT5ml)洗杂,并收集洗杂液。

备注?#21512;?#26434;液用于清洗一些非特异吸附的杂质蛋白。

e.洗脱

用5-10CV洗脱液以0.5ml/min(1ml)或2.0ml/min(5ml)进行洗脱,并收集洗脱液。

备注:低流速常常能增加洗脱液中目标蛋白的浓度

f.水洗

用5-10CV纯化水以0.5ml/min(1ml)或2.0ml/min(5ml)清洗介质

备注:此步骤用于去除介质中洗脱液。

g.保存

用5-10CV 20%乙?#23478;?.5ml/min(1ml)或2.0ml/min(5ml)清洗介质后保存。

备注:20%乙醇可以防止微生物的生长,20%乙醇保存的介质可以在4-304-8℃更佳)保存。

h.溶液配制(如果是包涵体纯化,在下述?#33014;?#28082;、洗杂液、洗脱液中添加8M尿素或6M盐酸胍)

?#33014;?#28082;:0.02M PB、0.5M NaCl,调节pH 7.4,室温保存。

备注:?#33014;?#28082;中NaCl是为了抑制介质的离子交换作用

洗杂液:0.02M PB、0.5MNaCl、0.005-0.01M咪唑,调节pH 7.4,室温保存。

备注:根据最终使用需求:非变性样品纯化?#20445;?#22312;洗杂液中加入0.005-0.01M 咪唑(优先考虑回收率)或者直接在?#33014;?#28082;中加入0.005-0.01M咪唑(优先考虑纯度);变性样品纯化?#20445;胶?#28082;中建议不可加入0.005-0.01M 咪唑,否则结合强?#21462;?#36733;量均会有一定的下降

洗脱液:0.02M PB、0.5M NaCl、0.5M咪唑 ,调节pH7.4,室温保存。

备注:一般情况下,洗脱液中咪唑浓度在0.02-0.10M?#32431;上?#33073;下目标蛋白

3.清洗

清洗后可以去除一些强结合性物质(例如一些强结合的蛋白、变性蛋白、脂类等),从而达?#20132;?#22797;介质的优良性能(例如载量、流动性、柱效等)。

建议每使用5-10次后进行一次清洗,具体清洗频?#24066;?#26681;据纯化的初始样品的洁净度进行调整。

a.用5-10倍柱体积纯化水冲洗。

备注:用于去除洗脱液(使用后直?#24551;?#27927;)或20%乙醇(使?#20204;?#28165;洗)

b.用5-10倍柱体积1M NaOH后静置0.5-1小时,再用10-20倍柱体积纯化水冲洗直至pH至中性。

备注:用于去除聚集在介质中的沉淀蛋白或疏水性结合蛋白或脂蛋白等。

c.用5-10倍柱体积的20%乙醇冲洗后保存。

备注:20%乙醇可以防止微生物的生长,20%乙醇保存的介质可以在4-30℃(4-8℃更佳)保存。

4.应用案例

案例一



备注:由案例一可知:0.02M DTT对纯化结果无影响。

案例二



备注:由案例二可知:0.1M EDTA或0.01M DTT对纯化结果几乎无影响。

5.常见问题

表2:常见问题及解决方案

问题

可能原因

解决方案

纯化时目标物不与介质结合

或结合量?#31995;?/span>

1.上样?#25239;?#36733;

降低上样量

2.上样速度过快

降低上样流速

3.蛋白或脂类在介质中聚集影响结合

及时有效地清洗介质或更换新的介质

4.表达条件过于剧烈,His标签被包裹,不能与介质结合

建议做一个空载体作为表达和纯化的对照,确定表达条件是否合适

5.初始样?#20998;?#27809;有组氨酸标签蛋白

通过基因序列或His标签抗体核实

6.目标蛋白出现在流穿中

目标蛋白没有成功表达或样品和?#33014;?#28082;中pH和组分不正确

洗脱时没有收集到目标物

或只收集到少量目标物

1.目标物没有与介质结合或结合量较少

?#28909;?#35748;目标物是否与介质结合

2.洗脱条件不合适

加大洗脱液中咪唑浓度

3.洗脱时间?#36824;?/span>

降低流速,延长洗脱液的保留时间

4.洗脱体积过小

加大洗脱体积

5.洗脱液中洗脱能力太弱

加大洗脱液中咪唑浓度

6.洗杂?#20445;?#30446;的蛋白被洗下来

降低洗杂液中的咪唑浓度

7.目标物在洗脱液条件下出现聚集沉淀

检测目标物在洗脱液条件(pH和?#38395;?#24230;)下的溶解度和稳定性。可以尝试在洗脱液中加入一些添加剂:如0.2%Triton X-100或0.5% Tween 20

目标物纯度?#31995;?/span>

 

1.样品没有经过前处理

样品上柱前必须要经过离心或过滤

2.样品粘度过高

用?#33014;?#28082;适当的稀释样品,降低粘?#21462;?/span>

3.洗杂不彻底

加大洗杂体积直至基线平稳并与?#33014;?#28082;一致

4.杂质蛋白或脂类在介质中聚集沉淀

及时有效地清洗介质

5.杂质与Ni2+具有?#32454;?#30340;亲和力。

用其它类型介质进行纯化(如离子或分子筛)

6.目标物出现降解

检测目标物的稳定性并加入蛋白酶抑制剂

7.柱料装填效果不佳

重新装填或购买

8.杂质与介质出现非特异性吸附

适当选择添加剂降低非特异性吸附,可以尝试在样?#20998;?#21152;入一些添加剂:如0.5%Triton X-100、1.0% Tween 20或50%甘油

9.分离柱顶部有?#27927;?#20648;样体积

重新装柱或降低储样体积

10.介质中有微生物生长

介质使用完后,请及时正确保存介质

介质载量下降

1.上样速度过快

降低上样流速

2.蛋白或脂类在介质中聚集,导致载量下降。

及时清洗介质

3.使用?#38382;?#36807;多

更换新介质

4.表达条件过于剧烈,His标签被包裹,不能较好与介质结合

建议做一个空载体作为表达和纯化的对照,确定表达条件是否合适

色谱峰上升缓慢

介质装填过紧

重新装柱

色谱峰拖尾

介质装填太松

重新装柱

柱床有裂缝或干涸

出?#20013;?#38706;或大体积气泡引入

检查管路是否有泄露或气泡,重新装柱

液流?#19979;?/span>

1.蛋白或脂类聚集

及时清洗介质或?#22235;?/span>

2.蛋白沉淀在介质中

调整?#33014;庖汉?#27927;脱液组分,以维持目标物的稳定性和介质的结合效率

3.分离柱中微生物生长

所用试剂必须经过过滤和脱气;

样品上柱前必须离心或过滤

6.订购信息

表3:订购信息表

产品

规格(ml)

货号

Ni Focurose 6FF (TED

25

HZ1003-8

Ni Focurose 6FF (TED

100

HZ1003-8

Ni Focurose 6FF (TED

500

HZ1003-8

Ni Focurose 6FF (TED

1000

HZ1003-8

备注:大规格包装产品或其它产品购买,请咨询本公司当地销售或售前技术支持。

7.联系方式

武汉汇研生物科技股份有限公司

地址:武汉市东湖新技术开发区流芳园?#19979;?8号新特工业园

电话:027-8777 2229

网址:www.kw830.com

邮箱:[email protected]




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